GIBCO胎牛血清細胞凍存步驟：

　　1、在冷凍管上標記好日期、研究者姓名、細胞數(shù)、細胞傳代數(shù)和細胞類型（以及任何其他有用信息，比如遺傳修飾）。

　　2、如果細胞貼壁，則去除細胞培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌，加入足量胰蛋白酶覆蓋細胞并在 37°C 培養(yǎng)箱中孵育約 2 分鐘。在細胞培養(yǎng)基中重懸細胞并移入 50 mL Falcon 管中。

　　3、如果細胞為懸浮狀態(tài)，只需將所需體積細胞直接移入 50 mL Falcon 管中。

　　4、用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)以確定其活力。用于冷凍保存的細胞活力至少應(yīng)為 75%。

　　5、在室溫下以 1,000 rpm 離心 5 分鐘。

　　6、去除上清液，輕輕散開沉淀物。

　　7、添加冷凍培養(yǎng)基至所需的細胞密度。對于哺乳動物細胞，所需細胞密度通常為10^6/mL 冷凍培養(yǎng)基。在室溫下，細胞不應(yīng)在冷凍培養(yǎng)基中超過 10 分鐘。

　　8、在各冷凍管中各分裝 1 mL，并蓋緊蓋子。

　　9、室溫下將冷凍管移至 CoolCell 快速冷凍機中，然后放入 -80°C 冰箱中。CoolCell 快速冷凍機將確保溫度以 1°C/分鐘穩(wěn)步下降。

　　10、大約 24 小時后，從 CoolCell 快速冷凍機中取出冷凍管并轉(zhuǎn)移到液氮中長期儲存。

　　更換GIBCO胎牛血清有技巧：

　　a.不同來源或不同批次GIBCO血清的更換：在一個批次的血清快使用完畢，需更換使用不同來源或不同批次的血清時，宜讓細胞有一個逐步適應(yīng)新血清的過程，這樣就幾乎不會因為更換血清而影響細胞的生長狀態(tài)。具體的方法是，在初始使用舊批次血清的情況下，逐漸增加不同來源或不同批次血清的比例，例如把不同來源或不同批次血清的比例逐步調(diào)整為0%、30%、60-70%、100%。這樣經(jīng)過約3代細胞的逐漸適應(yīng)，細胞通常會在新來源或新批次的血清中生長良好。

　　b.從GIBCO血清更換成新生牛血清：有的些細胞，如HEK293、HEK293T、HeLa、CHO-K1、NIH3T3等常見細胞株通常是可以用新生牛血清培養(yǎng)的。如果之前是使用胎牛血清，想更換為新生牛血清培養(yǎng)，也需要讓細胞有一個逐步適生牛血清的過程。例如把新生牛血清的比例逐步調(diào)整為0%、30%、60-70%、100%。對于不太確定是否適合新生牛血清培養(yǎng)的細胞。

血清真假辨別：

　　一、外觀

　　拿到血清，先接觸的是血清外觀，對于缺少細胞培養(yǎng)經(jīng)驗的人來說，外觀的判斷尤為重要

　　1、GIBCO血清顏色

　　根據(jù)血紅蛋白含量的不同，胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色，我國的細胞培養(yǎng)用血清標準是不高于20mg/dl，實際上，血紅蛋白含量的高低對血清并無直接影響，這個指標的意義在于能體現(xiàn)出采血過程的嚴謹規(guī)范程度，良好的操作能降低血清的溶血。

　　假的血清的采血點很分散，大多是由屠戶采血后馬上離心收集，所以很少會有溶血，表現(xiàn)出明亮的蠟黃色，當然，假的血清也很少有標準意義上的胎牛血清。

　　進口血清或多或少總有點溶血，因為真正的血清凝血功能差，紅細胞容易破裂。

　　總的來說，假的的血清呈現(xiàn)出蠟黃。進口的血清，質(zhì)量好的呈現(xiàn)出談黃、微紅色，差點的呈現(xiàn)出橘紅色或鮮紅色。當然，熱滅活血清或保存不當?shù)难澹捎谘t蛋白的破壞氧化，會呈現(xiàn)出暗紅，甚至咖啡色。

　　2、GIBCO血清沉淀

　　很多血清客戶，會發(fā)現(xiàn)進口血清有沉淀，從而懷疑血清的質(zhì)量問題，這是沒有根據(jù)的。

　　血清中的沉淀是由纖維蛋白的凝聚產(chǎn)生，對血清質(zhì)量沒有任何影響，沉淀的產(chǎn)生原因很多，和廠家的加工生產(chǎn)方式密切相關(guān)。

　　假的的血清，大多來自北方，由于價格低廉，保存環(huán)境都不好，從采血、冷凍、運輸?shù)缴a(chǎn)會經(jīng)過多次凍融，每次凍融過程，就會析出部分纖維蛋白沉淀，這樣，血清成品過濾后看起來反而更加的“干凈”，很少有沉淀產(chǎn)生。

　　GIBCO血清過濾分裝前很少會反復(fù)凍融，生產(chǎn)后的成品也是清澈的，但隨著時間的推移，血清中的大量纖維蛋白會析出形成沉淀。當然，進口的新生牛血清，一般牛齡都在2周左右，血清中的各種蛋白含量明顯偏高，生產(chǎn)后血清可能會渾濁，甚至有大量沉淀。

　　當然，購買回來的血清都是冰凍狀態(tài)，使用時需要融化，融化過程好在溫度較低的狀態(tài)下慢慢進行，否則沉淀相對較多，雖然沉淀并不直接影響血清的質(zhì)量，但對細胞的顯微觀察有一定的阻礙。